类器官消化液（Organoids Digestuin Solutuion）

类器官消化液（Organoids Digestion Solution）使用说明书

产品介绍

本品为无色透明溶液。可将类器官样本温和、快速地消化解离为细胞簇或细胞团块，可用于后续类器官的扩增。仅供科研用途。

产品规格

使用说明

本品为冰袋冷链运输，收到货后需-20℃保存，保质期为12个月。可短暂保存在4℃一个月。

1. 类器官收集

1. 吸弃原培养液。
2. 缓慢少量加入预冷的清洗液（也可用含1%抗生素的PBS）。
3. 吹打基质胶，将基质胶与类器官吹散。

【注1】：若有类器官出现贴壁，使用枪头将类器官刮下。

4. 将类器官与清洗液混合液转移至 15ml 离心管中。
5. 清洗液补足至12ml。
6. 放入-20℃冰箱静置6min，或4℃冰箱静置30min。

【注2】：短暂的低温不会对类器官活性造成影响。利用基质胶低温溶解的特性，降温后离心去除。

7. 300g/1500rpm 离心 5min ，弃上清。

2. 类器官消化

机械分散：机械破碎适用于空泡状类器官或薄壁类器官(如下图）。

1. 加入1-2ml清洗液吹打。
2. 当类器官大小为40-200um的细胞块时，即可停止。
3. 清洗液补足至12ml后。
4.  300g/1500rpm 离心 5min。

机械破碎和酶法分散：机械破碎和酶法分散适用于囊状类器官或厚壁状类器官（如下图）。

1. 加入1-2ml室温平衡后的类器官消化液吹打。
2. 放置37℃培养箱中静置消化。
3. 每隔2min从培养箱中取出，使用1ml移液器反复吹打10-30次。倒置显微镜下观察消化程度，消化液消化时间不可超过6min。

【注13】：注意防止消化过度，消化为单细胞。

4. 当类器官大小为40-200um的细胞块时，即可停止。
5. 使用稀释消化液的方式终止消化过程。15ml离心管中清洗液补足至12ml。
6.  300g/1500rpm 离心 5min 弃上清。

3. 扩增培养

1. 根据类器官沉淀体积，按照V_类器官：V_基质胶=1:15的比例加入低因子无酚红基质胶（提前一夜4℃溶解）。
2. 置于冰上/冰盒上，使用200µl枪头吹打，将细胞沉淀与基质胶混匀。
3. 若此过程基质胶中产生气泡，可将气泡以下的基质胶吸尽后，离心管用力敲打桌面，将气泡震破。
4. 以24孔板为例，将基质胶-细胞悬液均匀的滴在培养孔中央，每滴20-60µl。

【注14】：a-d过程需要全程在冰上操作，离心结束后尽量将上清吸尽。基质胶浓度保持在70%以上，确保凝固后的基质胶保持穹顶状。

5. 将滴有基质胶-细胞悬液的培养板放入37℃培养箱中，使基质胶凝固。
6. 15min后每孔加入500µl室温平衡的人胰腺癌类器官培养基。

【注15】：根据实验需求，将所需体积的培养基提前放置室温平衡15min。

7. 在37℃、5% CO₂和21% O₂细胞培养箱中培养。
8. 每2-4天更换一次培养基。

【注16】：若细胞密度过高，培养1天后出现培养液变黄现象，需每天换液，且需尽快传代，稀释细胞密度。

若培养过程中出现微生物污染，可在对应的孔中加入1ml 3.5mM NaOH溶液，4h后吸弃液体。