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卵巢癌类器官培养基(Ovarian Cancer Organoid)

产品规格:100mL/500mL
产品货号:RSQ-OCM1010
无血清培养基,成分明确
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产品详情

 

人卵巢癌类器官培养试剂盒说明书

 

产品及货号

包装规格

组分编号

组分名称

包装

人卵巢癌类器官培养试剂盒

(RSQ-OCK1010)

3-5例

RSQ-OCM1010

卵巢癌类器官培养基

100ml

RSQ-OSR001

组织消化液

50ml

RSQ-OSR003

类器官消化液

40ml

RSQ-OSR004

类器官冻存液

40ml

RSQ-OSR002

组织保存液

100ml

RSQ-OSR005

清洗液

500ml

保存条件:-20℃ ~ 4 ℃保存。保质期6个月

 

实验流程

  • 从原代组织建立类器官

注意:涉及到人原代组织的研究须遵循国家人类遗传资源管理条例,符合所有相关的机构和政府规定,并获取伦理委员会批准。在收集人原代组织材料之前,须得到受试者的知情同意

类器官培养基、组织消化液储存温度:-20℃ ~ 4℃

  1. 人卵巢癌组织取样
  1. 检查组织保存液是否过期、漏液以及有无变色或浑浊。
  2. 于无菌条件下打开组织保存液,将组织保存液分装至15ml或50ml无菌离心管中请尽量缩短保存液在空气中的暴露时间。
  3. 将人卵巢癌组织取下用无菌镊将卵巢癌组织放于组织保存液中。

1】:组织取样详情请参考常见问题1。

  1. 确保样本组织完全浸泡于液体后,立即旋紧管盖,并用封口膜将管盖和管颈的缝隙密封。
  2. 注意样本离体后应尽快放入组织保存液中。样本在环境中暴露时间越长,活性越低,受污染的风险也越高。

2】:组织样本在保存液中的正确保存方式参考常见问题2。

  1. 运输

组织清洗液清洗后卵巢癌样本尽快放入组织保存液中,样本须4℃低温保存快速转运,确保样本安全、准确、及时送达实验室进行后续类器官构建工作

  1. 组织清洗
  1. 将样本组织放置于培养皿中,剪成米粒大小2-4mm3

3】:若在剪切时有肿瘤细胞掉落,可收集清洗液,离心后去上清加入新的清洗液,再次离心去上清,反复清洗3次。清洗结束后的细胞沉淀可直接与基质胶混匀后种到细胞培养板中,或过100um滤网后与基质胶混匀。

  1. 使用5-10ml组织清洗液反复吹打清洗
  2. 吸去清洗液
  3. 重复以上(b,c)两步,清洗组织5-10次。
  1. 原组织分析
  1. 1-2块有代表性的组织块,用固定液进行固定(10%福尔马林或4%多聚甲醛)。
  2. 1-2块有代表性的组织块,用RNAlater浸泡,-80℃速冻组织块,可进行分子(全外显子组/基因组测序或mRNA测序)或生化分析(Western blotting或蛋白质组学)。
  1. 组织剪切
  1. 将清洗后的组织块收集到1.5ml EP管中,使用无菌尖头眼科手术剪将组织块尽量剪碎组织剪切程度与消化时间息息相关,剪切程度越高则消化时间越短。
  2. 将剪碎后的组织转移至15ml无菌离心管中
  1. 组织消化
  1. 加入6ml组织消化液,使用封口膜将离心管管口密封,放入37℃水浴锅中水浴消化。
  2. 使用涡旋混匀仪,每隔5min震荡30s,并吸出30ul组织悬液显微镜下观察。
  3. 消化时间控制在40min,当视野中观察到悬液中有10-100个100um左右的细胞团快时,即可停止消化。

【注4】:仔细观察消化状态,过度消化(消化为单细胞)会影响成功率以及降低生长效率。

【注5】:对于人卵巢癌组织应尽量剪碎,减短消化时间,消化时间控制在30-60min。

  1. 将组织与消化液悬液过100µm细胞滤网,加入清洗液补足至26ml。

【注6】:活检组织样本消化后为了减少细胞的丢失,不过滤,直接加入清洗液,300g/1500rpm离心5min后,弃上清

  1. 将过滤后的细胞悬液均匀的分到两个15ml离心管中,300g/1500rpm,离心5min,离心后去上清。
  2. 若离心后沉淀中观察到明显的红色沉淀(红细胞),加入2ml红细胞裂解液吹打混匀后室温放置3min

7】:组织离体时间超过48h,不建议进行红细胞裂解。

  1. 加入10ml清洗液。
  2. 300g/1500rpm离心5min后弃上清
  1. 培养
  1. 根据组织沉淀体积,按照V组织V基质胶 = 1:10的比例加入低因子无酚红基质胶(提前一夜4℃溶解)
  2. 置于冰上/冰盒上,使用200µl枪头吹打,将细胞沉淀与基质胶混匀。
  3. 若此过程基质胶中产生气泡,可将气泡以下的基质胶吸尽后,离心管用力敲打桌面,将气泡震破。
  4. 24孔板为例,将基质胶-细胞悬液均匀的滴在培养孔中央,每滴20-60µl。

8】:a-d过程需要全程在冰上操作,离心结束后尽量将上清吸尽。基质胶浓度保持在70%以上,确保凝固后的基质胶保持穹顶状

  1. 将滴有基质胶-细胞悬液的培养板放入37℃培养箱中,使基质胶凝固。
  2. 15min后每孔加入500µl室温平衡的人卵巢癌类器官培养基。

9】:根据实验需求,将所需体积的培养基提前放置室温平衡15min

  1. 37℃、5% CO221% O2细胞培养箱中培养
  2. 2-4天更换一次培养基

10】:若细胞密度过高,培养1天后出现培养液变黄现象,需每天换液,且需尽快传代,稀释细胞密度。

  1. 若培养过程中出现微生物污染,可在对应的孔中加入1ml 3.5mM NaOH溶液,4h后吸弃液体。
  • 类器官扩增

类器官是通过机械分散或机械破碎和酶法分散的组合来传代的。分解后的类器官经过清洗,并重悬在新的基质胶中。两种方法均不可将类器官过度消化为单细胞。

类器官消化液储存温度:-20℃ ~ 4℃。

  1. 类器官收集
  1. 吸弃原培养液
  2. 缓慢少量加入预冷的清洗液(也可用含1%抗生素的PBS)
  3. 吹打基质胶,将基质胶与类器官吹散

11】:若有类器官出现贴壁,使用枪头将类器官刮下

  1. 将类器官与清洗液混合液转移至 15ml 离心管中。
  2. 清洗液补足至12ml。
  3. 放入-20℃冰箱静置6min,或4℃冰箱静置30min。

12】:短暂的低温不会对类器官活性造成影响利用基质胶低温溶解的特性,降温后离心去除。

  1. 300g/1500rpm 离心 5min ,弃上清
  1. 类器官消化

机械分散:机械破碎适用于空泡状类器官或薄壁类器官。

  1. 加入1-2ml清洗液吹打
  2. 当类器官大小为40-200um的细胞块时,即可停止
  3. 清洗液补足至12ml后
  4.  300g/1500rpm 离心 5min

机械破碎和酶法分散:机械破碎和酶法分散适用于囊状类器官或厚壁状类器官。

  1. 加入1-2ml室温平衡后的类器官消化液吹打
  2. 每吹打2min倒置显微镜下观察此,消化液消化时间不可超过6min

13】:注意防止消化过度,消化为单细胞。

  1. 当类器官大小为40-200um的细胞块时,即可停止。
  2. 清洗液补足至12ml后.
  3.  300g/1500rpm 离心 5min 弃上清
  1. 扩增培养
  1. 根据类器官沉淀体积,按照V类器官V基质胶=1:15比例加入低因子无酚红基质胶(提前一夜4℃溶解)
  2. 置于冰上/冰盒上,使用200µl枪头吹打,将细胞沉淀与基质胶混匀。
  3. 若此过程基质胶中产生气泡,可将气泡以下的基质胶吸尽后,离心管用力敲打桌面,将气泡震破。
  4. 24孔板为例,将基质胶-细胞悬液均匀的滴在培养孔中央,每滴20-60µl。

14】:a-d过程需要全程在冰上操作,离心结束后尽量将上清吸尽。基质胶浓度保持在70%以上,确保凝固后的基质胶保持穹顶状

  1. 将滴有基质胶-细胞悬液的培养板放入37℃培养箱中,使基质胶凝固。
  2. 15min后每孔加入500µl室温平衡的人卵巢癌类器官培养基。

15】:根据实验需求,将所需体积的培养基提前放置室温平衡15min

  1. 37℃、5% CO221% O2细胞培养箱中培养
  2. 2-4天更换一次培养基

16】:若细胞密度过高,培养1天后出现培养液变黄现象,需每天换液,且需尽快传代,稀释细胞密度。

  1. 若培养过程中出现微生物污染,可在对应的孔中加入1ml 3.5mM NaOH溶液,4h后吸弃液体。

 

  • 类器官冻存及复苏

类器官状态不佳时,进行冻存会影响复苏效率,因此冻存前的类器官必须处在最佳生长状态。选择类器官生长旺盛期进行冻存,根据不同样本的生长特性来选择最佳冻存时机,如生长快速的类器官传代直径或最大生长直径在300-500µm,则选择在类器官直径在150-200µm最佳;生长缓慢的类器官传代直径或最大生长直径为100-300µm,则选择类器官直径为100-150µm时冻存。

类器官冻存液储存温度:-20℃ ~ 4℃

【注意】在类器官冻存过程中,需要尽量保持类器官的完整,因此在吹打时需要格外轻柔。

  1. 类器官收集
  1. 吸弃原培养液
  2. 缓慢少量加入预冷的清洗液(也可用含1%抗生素的PBS)
  3. 吹打基质胶,将基质胶与类器官吹散

17】:若有类器官出现贴壁,使用枪头将类器官刮下

  1. 将类器官与清洗液混合液转移至 15ml 离心管中。
  2. 清洗液补足至12ml。
  3. 放入-20℃冰箱静置6min,或4℃冰箱静置30min。

18】:短暂的低温不会对类器官活性造成影响利用基质胶低温溶解的特性,降温后离心去除。

  1. 300g/1500rpm 离心 5min ,弃上清
  1. 类器官冻存
  1. 根据类器官沉淀体积,按照V类器官V冻存液=1:10的比例加入适量冻存液。
  2. 分装至冻存管中,使用程序降温法梯度降温。
  3. 经此方法冻存的类器官可在-80℃短期保存1个月,长期保存可转入液氮罐中。
  1. 类器官复苏
  1. 15ml离心管中加入2ml预先平衡至室温的清洗液(清洗液中可加入2%的血清)。
  2. 从液氮罐中取出冻存管,37℃水浴解冻1-2分钟。

19】:最佳解冻状态为冻存管中大部分为液体状态,中间稍微有一点冻滴,即冻存管中依然为低温状态(过度升温影响类器官活性)。

  1. 将解冻的类器官悬液缓慢转移至15ml离心管中。
  2. 加入8ml清洗液。
  3. 300g/1500rpm 离心 5min ,弃上清。
  4. 加入2ml预先平衡至室温的清洗液(无血清),轻柔吹打重悬类器官。
  5. 加入8ml清洗液。
  6. 300g/1500rpm 离心 5min ,弃上清。
  1. 复苏培养
  1. 根据类器官沉淀体积,按照V类器官V基质胶=1:10比例加入低因子无酚红基质胶(提前一夜4℃溶解)
  2. 置于冰上/冰盒上,使用200µl枪头吹打,将细胞沉淀与基质胶混匀。
  3. 若此过程基质胶中产生气泡,可将气泡以下的基质胶吸尽后,离心管用力敲打桌面,将气泡震破。
  4. 24孔板为例,将基质胶-细胞悬液均匀的滴在培养孔中央,每滴20-60µl。

20】:a-d过程需要全程在冰上操作,离心结束后尽量将上清吸尽。基质胶浓度保持在70%以上,确保凝固后的基质胶保持穹顶状

  1. 将滴有基质胶-细胞悬液的培养板放入37℃培养箱中,使基质胶凝固。
  2. 15min后每孔加入500µl室温平衡的人卵巢癌类器官培养基。

21】:根据实验需求,将所需体积的培养基提前放置室温平衡15min

  1. 37℃、5% CO221% O2细胞培养箱中培养
  2. 2-4天更换一次培养基

22】:若细胞密度过高,培养1天后出现培养液变黄现象,需每天换液,且需尽快传代,稀释细胞密度。

  1. 若培养过程中出现微生物污染,可在对应的孔中加入1ml 3.5mM NaOH溶液,4h后吸弃液体。


常见问题:

  1. 人卵巢癌组织取样方式
  1. 手术组织:针对卵巢癌肿瘤,尽量选择肿瘤实体部位进行取样,对于存在异质性的病变,应在全面观察的基础上多点取样至少取黄豆大小的组织块。
  2. 活检组织:对卵巢癌可根据肿瘤生长方式选择深挖或多点采样的活检方式。至少取3块2~3mm大小富含肿瘤细胞的组织块。
  3. 取出卵巢癌组织后,使用清洗液清洗3-5次,尽快放入组织保存液中短暂保存。

 

图片来源于网络

 

  1. 组织样本保存方式

组织样本保存在保存液中,用封口膜密封保存液管盖 2A:正确;2B:错误(未缠封口膜);2C:正确(拧紧保存液管盖);2D:错误(管盖未拧紧);2E:正确(样本取出后将其放入红色保存液中);2F:错误(放入清洗液中);2G:正确(组织样本较大时,应放入含有保存液的50 mL离心管中);2H:错误(组织样本较大时,放入15 mL离心管中)

参考文献中国经内镜消化系统常见恶性肿瘤组织取样及类器官培养专家共识(2024).中华消化内镜杂志.2024;41(5):337-350.

  1. 组织运输方式
  1. 使用气泡膜/纱布/无菌纸巾将浸泡有组织的组织保存管包裹一圈,防止冰袋与保存管直接接触。
  2. 放入保温泡沫箱中,加入2-4个冰袋,保持0~8℃快递运输。
  3. 收到货后,根据步骤一、从原代组织建立类器官流程,尽快处理组织样本。