肝细胞癌类器官培养基（Hepatocellular Carcinoma Organoid）

人肝癌类器官培养试剂盒说明书

 

产品及货号	包装规格	组分编号	组分名称	包装
人肝细胞癌类器官培养试剂盒 (RSQ-OCK1006-Kit)	3-5例	RSQ-OCM1006	肝细胞癌类器官培养基	100ml
		RSQ-OSR001	组织消化液	50ml
		RSQ-OSR003	类器官消化液	40ml
		RSQ-OSR004	类器官冻存液	40ml
		RSQ-OSR002	组织保存液	100ml
		RSQ-OSR005	清洗液	500ml

保存条件：-20℃ ~ 4 ℃保存。保质期6个月

 

实验流程

• 从原代组织建立类器官

注意：涉及到人原代组织的研究，须遵循国家人类遗传资源管理条例，符合所有相关的机构和政府规定，并获取伦理委员会批准。在收集人原代组织材料之前，须得到受试者的知情同意。

类器官培养基、组织消化液储存温度：-20℃ ~ 4℃。

1. 人肝癌组织取样

1. 检查组织保存液是否过期、漏液以及有无变色或浑浊。
2. 于无菌条件下打开组织保存液，将组织保存液分装至15ml或50ml无菌离心管中，请尽量缩短保存液在空气中的暴露时间。
3. 将人肝癌组织取下，用无菌镊将肝癌组织放于组织保存液中。

【注1】：组织取样详情请参考常见问题1。

4. 确保样本组织完全浸泡于液体后，立即旋紧管盖，并用封口膜将管盖和管颈的缝隙密封。
5. 注意样本离体后应尽快放入组织保存液中。样本在环境中暴露时间越长，活性越低，受污染的风险也越高。

【注2】：组织样本在保存液中的正确保存方式参考常见问题2。

2. 运输

经组织清洗液清洗后的肝癌样本尽快放入组织保存液中，样本须4℃低温保存和快速转运，确保样本安全、准确、及时送达实验室进行后续类器官构建工作。

3. 组织清洗

1. 将样本组织放置于培养皿中，剪成米粒大小（2-4mm³）.

【注3】：若在剪切时有肿瘤细胞掉落，可收集清洗液，离心后去上清加入新的清洗液，再次离心去上清，反复清洗3次。清洗结束后的细胞沉淀可直接与基质胶混匀后种到细胞培养板中，或过100um滤网后与基质胶混匀。

2. 使用5-10ml组织清洗液反复吹打清洗。
3. 吸去清洗液。
4. 重复以上（b，c）两步，清洗组织5-10次。

4. 原组织分析

1. 取1-2块有代表性的组织块，用固定液进行固定（10%福尔马林或4%多聚甲醛）。
2. 取1-2块有代表性的组织块，用RNAlater浸泡，-80℃速冻组织块，可进行分子（全外显子组/基因组测序或mRNA测序）或生化分析（Western blotting或蛋白质组学）。

5. 组织剪切

1. 将清洗后的组织块收集到1.5ml EP管中，使用无菌尖头眼科手术剪将组织块尽量剪碎。组织剪切程度与消化时间相关，剪切程度越高则消化时间越短。
2. 将剪碎后的组织转移至15ml无菌离心管中。

6. 组织消化

1. 加入6ml组织消化液，使用封口膜将离心管管口密封，放入37℃水浴锅中水浴消化。
2. 使用涡旋混匀仪，每隔5min震荡30s，并吸出30ul组织悬液显微镜下观察。
3. 消化时间控制在40min，当视野中观察到悬液中有10-100个100um左右的细胞团快时，即可停止消化（如下图）。

【注4】：仔细观察消化状态，过度消化（消化为单细胞）会影响成功率以及降低生长效率。

【注5】：对于人肝癌组织应尽量剪碎，减短消化时间，消化时间控制在20-60min。

将组织与消化液悬液过100µm细胞滤网，加入清洗液补足至26ml。

【注6】：活检组织样本消化后为了减少细胞的丢失，不过滤，直接加入清洗液，300g/1500rpm离心5min后，弃上清。

5. 将过滤后的细胞悬液均匀的分到两个15ml离心管中，300g/1500rpm/1500rpm，离心5min，离心后去上清。
6. 若离心后沉淀中观察到明显的红色沉淀（红细胞），加入2ml红细胞裂解液，吹打混匀后室温放置3min。

【注7】：若组织离体时间超过48h，不建议进行红细胞裂解。

7. 加入10ml清洗液。
8. 300g/1500rpm离心5min后，弃上清。

7. 培养

1. 根据组织沉淀体积，按照V_组织：V_基质胶 = 1:10的比例加入低因子无酚红基质胶（基质胶提前一夜4℃溶解）。
2. 置于冰上/冰盒上，使用200µl枪头吹打，将细胞沉淀与基质胶混匀。
3. 若此过程基质胶中产生气泡，可将气泡以下的基质胶吸尽后，离心管用力敲打桌面，将气泡震破。
4. 以24孔板为例，将基质胶-细胞悬液均匀的滴在培养孔中央，每滴20-60µl。

【注8】：a-d过程需要全程在冰上操作，离心结束后尽量将上清吸尽。基质胶浓度保持在70%以上，确保凝固后的基质胶保持穹顶状。

5. 将滴有基质胶-细胞悬液的培养板放入37℃培养箱中，使基质胶凝固。
6. 15min后每孔加入500µl室温平衡的人肝癌类器官培养基。

【注9】：根据实验需求，将所需体积的培养基提前放置室温平衡15min。

7. 在37℃、5% CO₂和21% O₂细胞培养箱中培养。
8. 每2-4天更换一次培养基。

【注10】：若细胞密度过高，培养1天后出现培养液变黄现象，需每天换液，且需尽快传代，稀释细胞密度。

1. 若培养过程中出现微生物污染，可在对应的孔中加入1ml 3.5mM NaOH溶液，4h后吸弃液体。

• 类器官扩增

类器官是通过机械分散或机械破碎和酶法分散的组合来传代的。分解后的类器官经过清洗，并重悬在新的基质胶中。两种方法均不可将类器官过度消化为单细胞。

类器官消化液储存温度：-20℃ ~ 4℃。

1. 类器官收集

1. 吸弃原培养液。
2. 缓慢少量加入预冷的清洗液（也可用含1%抗生素的PBS）。
3. 吹打基质胶，将基质胶与类器官吹散。

【注11】：若有类器官出现贴壁，使用枪头将类器官刮下。

4. 将类器官与清洗液混合液转移至 15ml 离心管中。
5. 清洗液补足至12ml。
6. 放入-20℃冰箱静置6min，或4℃冰箱静置30min。

【注12】：短暂的低温不会对类器官活性造成影响。利用基质胶低温溶解的特性，降温后离心去除。

7. 300g/1500rpm 离心 5min ，弃上清。

2. 类器官消化

机械分散：机械破碎适用于空泡状类器官或薄壁类器官。

1. 加入1-2ml清洗液吹打。
2. 当类器官大小为40-200um的细胞块时，即可停止。
3. 清洗液补足至12ml后。
4.  300g/1500rpm 离心 5min。

机械破碎和酶法分散：机械破碎和酶法分散适用于囊状类器官或厚壁状类器官（如下图）。

1. 加入1-2ml室温平衡后的类器官消化液吹打。
2. 每吹打2min倒置显微镜下观察此，消化液消化时间不可超过6min。

【注13】：注意防止消化过度，消化为单细胞。

3. 当类器官大小为40-200um的细胞块时，即可停止。
4. 清洗液补足至12ml后.
5.  300g/1500rpm 离心 5min 弃上清。

3. 扩增培养

1. 根据类器官沉淀体积，按照V_类器官：V_基质胶=1:15的比例加入低因子无酚红基质胶（提前一夜4℃溶解）。
2. 置于冰上/冰盒上，使用200µl枪头吹打，将细胞沉淀与基质胶混匀。
3. 若此过程基质胶中产生气泡，可将气泡以下的基质胶吸尽后，离心管用力敲打桌面，将气泡震破。
4. 以24孔板为例，将基质胶-细胞悬液均匀的滴在培养孔中央，每滴20-60µl。

【注14】：a-d过程需要全程在冰上操作，离心结束后尽量将上清吸尽。基质胶浓度保持在70%以上，确保凝固后的基质胶保持穹顶状。

5. 将滴有基质胶-细胞悬液的培养板放入37℃培养箱中，使基质胶凝固。
6. 15min后每孔加入500µl室温平衡的人肝癌类器官培养基。

【注15】：根据实验需求，将所需体积的培养基提前放置室温平衡15min。

7. 在37℃、5% CO₂和21% O₂细胞培养箱中培养。
8. 每2-4天更换一次培养基。

【注16】：若细胞密度过高，培养1天后出现培养液变黄现象，需每天换液，且需尽快传代，稀释细胞密度。

1. 若培养过程中出现微生物污染，可在对应的孔中加入1ml 3.5mM NaOH溶液，4h后吸弃液体。

 

• 类器官冻存及复苏

类器官状态不佳时，进行冻存会影响复苏效率，因此冻存前的类器官必须处在最佳生长状态。选择类器官生长旺盛期进行冻存，根据不同样本的生长特性来选择最佳冻存时机，如生长快速的类器官传代直径或最大生长直径在300-500µm，则选择在类器官直径在150-200µm最佳；生长缓慢的类器官传代直径或最大生长直径为100-300µm，则选择类器官直径为100-150µm时冻存。

类器官冻存液储存温度：-20℃ ~ 4℃。

【注意】在类器官冻存过程中，需要尽量保持类器官的完整，因此在吹打时需要格外轻柔。

1. 类器官收集

1. 吸弃原培养液。
2. 缓慢少量加入预冷的清洗液（也可用含1%抗生素的PBS）。
3. 吹打基质胶，将基质胶与类器官吹散。

【注17】：若有类器官出现贴壁，使用枪头将类器官刮下。

4. 将类器官与清洗液混合液转移至 15ml 离心管中。
5. 清洗液补足至12ml。
6. 放入-20℃冰箱静置6min，或4℃冰箱静置30min。

【注18】：短暂的低温不会对类器官活性造成影响。利用基质胶低温溶解的特性，降温后离心去除。

7. 300g/1500rpm 离心 5min ，弃上清。

2. 类器官冻存

1. 根据类器官沉淀体积，按照V_类器官：V_冻存液=1:10的比例加入适量冻存液。
2. 分装至冻存管中，使用程序降温法梯度降温。
3. 经此方法冻存的类器官可在-80℃短期保存1个月，长期保存可转入液氮罐中。

3. 类器官复苏

1. 15ml离心管中加入2ml预先平衡至室温的清洗液（清洗液中可加入2%的血清）。
2. 从液氮罐中取出冻存管，37℃水浴解冻1-2分钟。

【注19】：最佳解冻状态为冻存管中大部分为液体状态，中间稍微有一点冻滴，即冻存管中依然为低温状态（过度升温影响类器官活性）。

3. 将解冻的类器官悬液缓慢转移至15ml离心管中。
4. 加入8ml清洗液。
5. 300g/1500rpm 离心 5min ，弃上清。
6. 加入2ml预先平衡至室温的清洗液（无血清），轻柔吹打重悬类器官。
7. 加入8ml清洗液。
8. 300g/1500rpm 离心 5min ，弃上清。

4. 复苏培养

1. 根据类器官沉淀体积，按照V_类器官：V_基质胶=1:10的比例加入低因子无酚红基质胶（提前一夜4℃溶解）。
2. 置于冰上/冰盒上，使用200µl枪头吹打，将细胞沉淀与基质胶混匀。
3. 若此过程基质胶中产生气泡，可将气泡以下的基质胶吸尽后，离心管用力敲打桌面，将气泡震破。
4. 以24孔板为例，将基质胶-细胞悬液均匀的滴在培养孔中央，每滴20-60µl。

【注20】：a-d过程需要全程在冰上操作，离心结束后尽量将上清吸尽。基质胶浓度保持在70%以上，确保凝固后的基质胶保持穹顶状。

5. 将滴有基质胶-细胞悬液的培养板放入37℃培养箱中，使基质胶凝固。
6. 15min后每孔加入500µl室温平衡的人肝癌类器官培养基。

【注21】：根据实验需求，将所需体积的培养基提前放置室温平衡15min。

7. 在37℃、5% CO₂和21% O₂细胞培养箱中培养。
8. 每2-4天更换一次培养基。

【注22】：若细胞密度过高，培养1天后出现培养液变黄现象，需每天换液，且需尽快传代，稀释细胞密度。

1. 若培养过程中出现微生物污染，可在对应的孔中加入1ml 3.5mM NaOH溶液，4h后吸弃液体。

 

常见问题：

1. 人肝癌组织取样方式

1. 手术组织：针对肝癌肿瘤，尽量选择肿瘤实体部位进行取样，对于存在异质性的病变，应在全面观察的基础上多点取样。蓝色区域为肿瘤组织，避免采集到正常组织部位。至少取1块黄豆大小的富含肿瘤细胞的组织块。
2. 肿块型病变，于病变顶部或侧缘表现为充血、糜烂、凹凸不平等部位取样。
3. 结节型病变，鉴于多结节性肝癌具有单中心和多中心两种起源方式，在不能排除由肝内转移引起的卫星结节的情况下，单个肿瘤最大直径≤ 3 cm 的肝癌组织，应全部取材。
4. 弥漫浸润型病变，于黏膜充血、肿胀、糜烂、溃疡、凹陷等病变显著的部位取样。
5. 肿瘤坏死严重或有空洞形成时应尽量取材坏死不严重的周边区域。
6. 实际取材的部位和数量还须根据肿瘤直径和数量等情况综合考虑。
7. 活检组织：对肝癌可根据肿瘤生长方式选择深挖或多点采样的活检方式。至少取3块2~3mm大小富含肿瘤细胞的组织块。
8. 取出肝癌组织后，使用清洗液清洗3-5次，尽快放入组织保存液中短暂保存。

 

参考文献：外科病理取材图解指南.2009年.第四军医大学出版社。

2. 人肝胸腹水取样

1. 患者听诊、影像学检查发现胸腔积液，胸腔穿刺后发现胸腔积液浑浊、乳糜性、血性或脓性。
2. 通过影像学或叩诊定位穿刺部位，消毒穿刺部位皮肤，麻醉穿刺部位，用中空孔针穿刺至胸膜腔内。
3. 抽取胸水至500ml 无菌容器，过程尽量保持无菌。

【注23】：如果是浓稠血性胸腹水，加0.01%肝素钠抗凝，清澈透明或者黄色可以不加。

4. 胸水收集后，密封，标注信息。

 

 

3. 组织样本保存方式

组织样本保存在保存液中，用封口膜密封保存液管盖　2A：正确；2B：错误（未缠封口膜）；2C：正确（拧紧保存液管盖）；2D：错误（管盖未拧紧）；2E：正确（样本取出后将其放入红色保存液中）；2F：错误（放入清洗液中）；2G：正确（组织样本较大时，应放入含有保存液的50 mL离心管中）；2H：错误（组织样本较大时，放入15 mL离心管中）。

参考文献：中国经内镜消化系统常见恶性肿瘤组织取样及类器官培养专家共识(2024).中华消化内镜杂志.2024;41(5):337-350.

4. 组织运输方式

1. 使用气泡膜/纱布/无菌纸巾将浸泡有组织的组织保存管包裹一圈，防止冰袋与保存管直接接触。
2. 放入保温泡沫箱中，加入2-4个冰袋，保持0~8℃快递运输。
3. 收到货后，根据步骤一、从原代组织建立类器官流程，尽快处理组织样本。