淋巴细胞分离液

1. 分离液的使用环境

1. 分离液需常温（37℃-15℃）避光保存，严禁冷藏冷冻保存；
2. 使用时严格遵循无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在18℃-22℃环境温度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生改变，造成分离效果不佳。

提取流程

1. 血液样本稀释

1. 将抗凝管中的血液转移至50ml离心管中，加入等体积PBS。

【注】稀释要求：用不含钙镁离子的缓冲液或培养基进行血液稀释。

2. 淋巴细胞的分离

1. 取无菌的15ml离心管，将1ml吸头伸入离心管底部1/4处，缓慢加入人外周血淋巴细胞分离液，添加4ml。
2. 将稀释的血样再次吹打混匀，使用1ml吸头或是3ml巴氏吸管，缓慢加入稀释的血样。

【注】缓慢加入血样，避免血样与分离液混合。

3. 最佳离心条件：20℃环境下，600g/2000rpm离心20min。
4. 离心后，离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层（如下图）。

5. 小心将离心后的离心管品翁转移至超净工作台中，移液器吸头插入血浆层液面下，随着液面逐渐下移，弃去血浆层液体。
6. 小心吸起淋巴细胞层细胞，收集至新的无菌15ml离心管中，尽可能多的收集淋巴细胞，但要避免吸入太多分离液。
7. 取装有淋巴细胞的离心管，缓慢加入PBS至10ml，1000rpm离心5min。

【注】若淋巴细胞层中有红细胞，首先加入1ml红细胞裂解液，作用2-5min。随后加入PBS至10ml，1000rpm离心5min。

8. 弃上清，按照V_细胞沉淀：V_培养基=1：50加入目的细胞培养基。
9. 将混合有淋巴细胞的培养基转移至24孔培养板中，每孔500-1000ul，放入37℃培养箱中培养。

若分离后的淋巴细胞暂不进行后续实验，弃上清后，加入10倍体积的细胞冻存液，混匀后转移至细胞冻存管中。程序降温冻存。